研究背景

在骨缺损修复过程中，受损部位会经历细胞募集、血管重建和新骨形成等一系列生物学过程。生物活性玻璃(bioactive glass, BG) 是一类能释放功能性离子、参与血管生成与成骨过程的生物材料，可通过释放功能性离子在血管生成与成骨过程中发挥关键作用。铜掺杂生物活性玻璃(CuBG) 能释放包括Cu²⁺、Ca²⁺和SiO₄^4-在内的多种离子，这些离子对组织再生具有促进作用。其中，Cu²⁺通过抑制缺氧诱导因子1α(HIF-1α) 在细胞核内与核外的降解来模拟缺氧效应，从而激活HIF-1信号通路，进一步上调血管内皮生长因子(VEGF) 和内皮型一氧化氮合酶(eNOS) 的表达，增强血管生成能力。此外，CuBG还能激活多种成骨相关信号通路，如MAPK、Wnt/β-连环蛋白和BMP-Smad通路等，富集细胞内成骨相关的miRNA，协同促进骨缺损修复。然而，在早期阶段，离子的快速释放会导致离子浓度升高和碱性增强，从而引发剧烈疼痛、溶血反应及过度炎症反应，最终阻碍骨再生进程。

源自骨髓间充质干细胞(BMSCs) 的小型胞外囊泡(sEVs) 被认为是一种安全有效的生物制剂，这些囊泡可被远端细胞摄取，并显著调节其功能与行为。sEVs不仅能够保留源细胞的优势特性，还能避免其潜在缺陷；同时其分子信号具有归巢效应、循环稳定性以及非免疫原性等特点，可有效募集细胞并促进组织修复。然而，在骨缺损条件下，BMSCs来源的sEVs存在产量有限、促血管生成与成骨能力不足等问题，严重限制了其在临床治疗中的应用。

本研究采用CuBG处理BMSCs，制备出小型胞外囊泡(sEVs)，并将其类比为“纳米振动激发器"(nano-vibration exciter)。通过激活HIF-1信号通路及其介导的自噬过程，将CuBG释放的离子信号转化为生化因子信号，从而更高效地发挥BG的成骨潜能，驱动组织的再生与修复。

1.sEVs的提取和表征

BG(60SiO₂-36CaO-4P₂O₅) 和CuBG(60SiO₂-34CaO-2CuO-4P₂O₅) 纳米颗粒均呈现球形结构，具有非晶相结构特征，平均粒径分别为467.31 nm和307.48 nm。CuBG具有良好的生物相容性，在作用于BMSCs后未引起sEVs粒径或形态的显著改变，避免了传统缺氧培养方法可能引发的细胞凋亡等副作用。CuBG释放的Cu²⁺通过抑制细胞核外羟化酶(PHD) 对脯氨酸残基的羟化作用，阻断细胞核内缺氧诱导因子抑制因子1(FIH-1) 的活性，从而抑制HIF-1α的降解，稳定HIF-1α蛋白。

2.CuBG-sEVs增强成骨活性的机制

CuBG能释放Cu²⁺、Ca²⁺和SiO₄^4-等多种促进组织再生的离子，其中，Cu²⁺通过抑制HIF-1α在细胞核内和核外的降解过程来模拟缺氧效应，从而激活HIF-1信号通路，并上调促血管生成miRNA的表达，特别是miR-210。在缺氧条件下，HIF-1α会进入细胞核，激活自噬相关基因，如微管相关蛋白1轻链3(LC3) 和beclin1，并诱导p62蛋白表达，从而调控自噬进程并增强sEVs的生成。此外，CuBG释放的Ca²⁺和SiO₄^4-等其他活性离子，也能够促进成骨相关miRNA的富集，如miR-218、miR-146a和miR-21。综上所述，CuBG以HIF-1信号通路及其介导的自噬激活作为核心调控机制，有效提升了CuBG-sEVs的产量并增强其成骨活性。

3.体外血管生成与骨形成

血管生成在骨形成过程中发挥着关键作用，能够输送组织再生必需的营养素、矿物质、生长因子和氧气。人脐静脉内皮细胞(HUVECs) 能够有效摄取sEVs，进而促进血管的生成。CuBG-sEVs可被HUVECs有效内化，并显著刺激其迁移能力，显示出在细胞间通讯的重要潜力。此外，CuBG-sEVs表现出更强的细胞募集能力，这可能与其上调miR-210表达水平有关。在miR-210调控的HIF-1α信号通路激活后，可促进VEGF的释放，进而诱导趋化因子SDF-1的表达，最终增强细胞募集过程。

此外，CuBG-sEVs能够有效上调包括VEGF、激酶插入结构域受体(KDR)、eNOS以及血小板内皮细胞黏附分子(CD31) 在内的多个血管生成关键基因的表达。在该调控作用下，细胞间连接性显著增强，并形成了典型的管状结构，新生血管数量与血管长度显著增加，充分证明了CuBG-sEVs在促进血管生成方面的显著效能。

原代间充质干细胞(MSCs) 的募集及其成骨分化在骨再生过程中具有关键作用。CuBG-sEVs富含多种与成骨相关的miRNA，如miR-218、miR-146a和miR-21，表现出显著的成骨潜力。经CuBG-sEVs处理后，多个成骨相关基因的表达均显著上调，包括碱性磷酸酶(ALP)、runt相关转录因子(RUNX2)、骨钙素(OCN)、骨形态发生蛋白2(BMP2) 和I型胶原α1(COL1A1) 等。其中，ALP和RUNX2的上调在骨基质合成与矿化初期阶段起着关键作用，而矿化基质含量的增加进一步促进了成骨进程。

CuBG-sEVs中的miRNA不仅可以通过调控Wnt/β-连环蛋白、PI3K/Akt和MAPK信号通路诱导BMSCs向成骨分化，更能精准靶向调控该过程的关键靶点，这种多层面的调控机制，充分印证了CuBG-sEVs作为CuBG优质替代品的应用价值。

4.体内血管生成与骨形成

作为递送载体使用的单宁酸包被明胶甲基丙烯酰基冷冻凝胶(TG)，展现出优异的生物相容性、机械性能和大孔结构。基于这些特性，它能高效吸附自噬体，并能实现对药物释放动力学的精准调控。

通过在大鼠颅骨临界缺损模型中的评估证实，CuBG-sEVs/TG能更有效地促进新骨形成。其疗效具体表现为骨体积分数(BV/TV)、骨小梁数量(Tb.N)和骨小梁厚度(Tb.Th) 的同步显著增加，凸显了CuBG-sEVs/TG在骨修复面积与骨再生质量两方面的全面优势。

CuBG-sEVs/TG引发了有序的骨愈合过程：缺损区快速形成连续新骨并向中心延伸，同时伴随细胞外基质的显著沉积与胶原纤维的致密化、成熟化。这充分证明了高活性CuBG-sEVs的持续释放能高效促成高质量骨再生。

CuBG-sEVs通过miR-210调控KDR/VEGF/eNOS信号轴，显著上调了血管关键蛋白CD31的表达，从而驱动HUVECs的粘附与聚集，有效促进了血管生成。所形成的血管网络为骨再生提供了必要的营养支持，其与成骨过程在时空上的高度耦合，表明CuBG-sEVs/TG通过促血管生成为成骨奠定了坚实的微环境基础。

CuBG-sEVs通过其中的miRNA(如miR-218、miR-146a和miR-21) 上调OCN表达以激活与成骨相关的信号通路；同时，引导骨基质的关键成分I型胶原形成有序、与内源性新骨强互联的结构框架，有效支持细胞迁移、定植及新骨的支持和保护。这两方面协同作用，共同强化了骨再生过程。

本研究开发了的纳米振动激发器CuBG-sEVs，通过HIF-1信号通路将CuBG的离子信号高效转化为miRNA信号，激活自噬过程，显著提升CuBG-sEVs产量。由此产生的CuBG-sEVs能被HUVECs和BMSCs快速内化，通过富集的miRNA发挥招募细胞、促进血管生成与成骨分化的双重效应。

此外，将CuBG-sEVs与TG冷冻凝胶联合应用于骨缺损部位，CuBG-sEVs通过驱动细胞募集、血管生成与成骨分化这一核心机制，有效支持骨缺损的全面再生；该过程伴随着加速血管生成与增强I型胶原沉积，从而显著提高了修复效率。此项工作证实了sEVs作为BG替代方案的巨大潜力，为提升骨再生疗效提供了新思路。